 |
Получение пробиотически ценных штаммов бифидобактерий
|
|
Д.С. Янковский, Г. С. Дымент, Е.П. Потребчук
Научно-производственная компания «О.Д. Пролисок», г. Киев
Введение
Одной из основных групп микроорганизмов, используемых в составе современных пробиотических препаратов, являются представители рода Bifidobacterium. Данный таксон сахаролитических анаэробов является важнейшим облигатным компонентом нормобиоценозов человека, ключевая физиологическая роль которого в функционировании микроэкологической системы здоровых людей убедительно доказана многочисленными исследованиями.
Грамположительные, аспорогенные, облигатно-анаэробные, сахаролитические бактерии рода Bifidobacterium преобладают в составе первичной физиологической микробиоты, формирующейся в неонатальном возрасте у здорового младенца и являются неотъемлемым компонентом нормофлоры взрослых людей всех возрастов. В кишечном биоценозе здоровых детей грудного возраста, находящихся на естественном вскармливании, бифидобактерии могут составлять до 99% всей микробной популяции.
Основная функция бифидодоминантной микрофлоры заключается в защите организма младенца от внешних инфекций и созревании эффективных механизмов иммунного ответа. У здоровых взрослых доля бифидофлоры составляет не менее 25% от общего количества анаэробных бактерий. В процессе старения организма наблюдается лишь некоторое снижение концентрации сахаролитической флоры (в том числе, бифидобактерий), что обусловлено возрастными метаболическими, гормональными и иммунными изменениями [1–3, 5, 6, 8, 10]. Из 32-х видов, составляющих, согласно современной классификации, род Bifidobacterium, 5 из них чаще других выделяются из кишечника здоровых людей и считаются наиболее физиологическими для организма человека, а
именно: B. bifidum, B. longum, B. infantis, B. breve и B. adolescentis [7, 10, 14]. Наиболее важными физиологическими функциями индигенных бифидобактерий в биотопах хозяина является участие в противоинфекционной и антитоксической защите, а также обменных процессах. Участие индигенной бифидофлоры в защите организма человека от патогенной микрофлоры реализуется как прямым воздействием на микробные клетки за счет синтеза бактерицидных компонентов, конкуренции за питательные ингредиенты, сайты адгезии и т. д., так и косвенно — за счет стимуляции иммунной системы [4, 6–10, 12–14]. Обменная и антитоксическая функция бифидофлоры осуществляется за счет биосинтетической активности, участия в пищеварении, метаболизме желчных кислот, холестерина, гормонов, ксенобиотиков, канцерогенов и других [4, 10].
Бактерии рода Bifidobacterium активно ферментируют углеводы с образованием уксусной и молочной кислоты. Отдельные штаммы могут накапливать в среде культивирования также небольшие количества муравьиной и янтарной кислоты. В результате закисления среды кишечника улучшается всасывание железа, кальция, витамина D, тормозятся гнилостные процессы, инактивируются многие вредные ферменты, предотвращается всасывание аммиака и других токсических метаболитов. Кроме того, органические кислоты, синтезируемые бифидобактериями, являются ценным энергетическим субстратом для эпителиоцитов, улучшающим их трофику [6, 7, 9, 10]. Бифидобактерии не продуцируют каталазу, углекислый газ, сероводород, не восстанавливают нитраты в нитриты, не разжижают желатин. Известна способность бифидобактерий синтезировать отдельные аминокислоты, полисахариды, витамины В1, В2, К, рибофлавин, тиамин, пиридоксин, пантотеновую и фолиевую кислоты и другие биологически активные метаболиты [2, 4, 10]. Однако следует учитывать, что эти свойства имеют не только межвидовые, но и внутривидовые различия. Штаммы с высокой биосинтетической активностью встречаются достаточно редко. Большинство бифидобактерий сами нуждаются в различных витаминах, аминокислотах и других факторах роста [2]. Снижение концентрации бифидобактерий ниже физиологической нормы является одним из патогенетических факторов дисфункции органов пищеварительной системы и нарушений нормальной деятельности многих других органов и систем. Установление многогранных, положительных воздействий бифидобактерий на здоровье человека способствовало широкому применению этих микроорганизмов в составе пробиотиков. На основе живой бифидофлоры создан широкий ассортимент препаратов, предлагаемых для коррекции дисбиотических нарушений, лечения острых и хронических кишечных инфекций, аллергий, иммунодефицитов и других патологических состояний [1–5, 6, 7, 9, 10]. Природная полиауксотрофность бифидофлоры, биосинтетическая недостаточность и потребность в строго анаэробных условиях роста преобладающего числа штаммов бифидобактерий затрудняет выделение многих физиологически ценных биовариантов, их культивирование в искусственных средах и создание на их основе высокоэффективных пробиотиков. При отборе бифидобактерий в состав пробиотических препаратов основное внимание уделяется их антагонистической активности, адгезивной способности, ферментативным и биосинтетическим свойствам. Одна из проблем перорального использования пробиотиков заключается в сложности получения пробиотических штаммов, резистентных к желудочному соку, желчи, лизоциму, протеолитическим ферментам и другиместественным ингибиторам пищеварительного тракта. С целью реализации данной проблемы при изготовлении многих пробиотиков лиофилизированную биомассу заключают в кислотоустойчивые капсулы, не растворяющиеся в желудке. Однако кислотоустойчивые капсулы мгновенно растворяются в щелочных условиях двенадцатиперстной кишки, среда которой не менее агрессивна для микрофлоры, чем такая полости желудка. Это приводит к массовой гибели бифидофлоры еще задолго до ее реактивации из лиофилизированного состояния. Поэтому вряд ли может вызывать сомнения целесообразность селекции и использования в составе пробиотиков штаммов бифидобактерий, выживающих как в кислой среде желудка, так и в агрессивных зонах тонкого отдела кишечника.
Такие микроорганизмы намного быстрее адаптируются и проявляют оздоровительное действие, чем заключенные в капсулу высушенные культуры, для активации которых требуется длительное время и комфортные условия, которые отсутствуют в организме человека.
Цель исследования — получение новых пробиотически ценных штаммов бифидобактерий с высокой резистентностью к желудочному соку, желчи, фенолу, лизоциму и протеолитическим ферментам, то есть основным
естественным ингибиторам проксимального отдела желудочно-кишечного тракта.
Материал и методы исследования
В работе были использованы штаммы бифидобактерий из коллекции микроорганизмов компании «О.Д. Пролисок», а также выделенные из кишечника здоровых людей. Идентификация штаммов проводилась согласно определителю Bergey's (1997).
Ферментация углеводов и их производных определялась в среде Гисса с различными углеводами. Инкубирование проводили при температуре 37°С в течение 72 ч, после чего регистрировалось изменение рН культуральной жидкости.
Синтез органических кислот изучали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием аппарата LS_6A производства фирмы «Shimadzu». Резистентность к фенолу определяли в среде Blaurock, в которую добавляли различные количества 8%-го стерильного водного раствора фенола. Пробирки со средой тщательно встряхивали и засевали 5% соответствующей культуры. Посевы инкубировали при температуре 37°С в течение 48 ч. Рост культуры или его отсутствие отмечали визуально с последующим определением концентрации клеток, сохранивших жизнеспособность. Резистентность к желчи определяли в среде Blaurock, в которую добавляли 20, 30 и 40% желчи. Посевы выдерживали в термостате в течение 16 ч при температуре 37°С с определением концентрации выживших клеток.
Для оценки резистентности штаммов к желудочному соку, культуры наращивали в среде Blaurock при оптимальной температуре в течение 48 ч, клетки осаждали центрифугированием в течение 10-ти мин и 3000 об./мин. Полученную биомассу смешивали в соотношении 1:1 с желудочным соком, выдерживали в течение 2_х ч. в термостате при емпературе 37°С и определяли концентрацию клеток, сохранивших жизнеспособность.
Резистентность к лизоциму определяли в среде Blaurock, в которую добавляли лизоцим в концентрации от 1 до 5 мг/мл, а резистентность к хлористому натрию — в той же среде, в которую добавляли NaCl в концентрации 2 и 4%.
Статистическая обработка полученных данных осуществлялась на персональном компьютере «OEM IBM PC/AT Pentium» при помощи программы «Excel». Вычисляли значения средней арифметической (М), среднего квадратического отклонения (ó), ошибки определения средней арифметической (m), коэффициента вариации (W), а также определяли уровень достоверности различий (p) сравниваемых групповых средних с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение
Сложность культивирования бифидобактерий in vitro представляет основные трудности при создании на их основе эффективных пробиотиков. По данным разных авторов, количество культивируемых анаэробных бактерий, заселяющих приэпителиальные биопленки открытых органов человека, составляет от 7 до 50% [6].
В процессе работы установлено, что в кишечном биотопе человека содержится не более 1% штаммов бифидофлоры, которые после изоляции из естественной экосистемы способны в чистой культуре сохранять свою жизнеспособность. Это свидетельствует не только о наличии в микробной системе большого количества бифидных штаммов, не способных развиваться in vitro, но и подтверждает ранее сделанные выводы о тесной симбиотической связи между отдельными индигеннымикомпонентами микробиоценозов. Разрушение таких связей приводит к серьезным дисбиотическим расстройствам [6, 7, 10]. Авторами разработан новый метод культивирования бифидобактерий in vitro, основанный на мощном стимулирующем действии особых штаммов-активаторов, в качестве которых используются специальные «молочные» расы уксуснокислых бактерий рода Acetobacter [11].
«Молочный» таксон уксуснокислых бактерий представляет собой группу апатогенных, облигатно аэробных, грамотрицательных, подвижных, бесспоровых палочковидных прокариот. Их биологическими особенностями является высокая кислотоустойчивость, окислительная способность относительно широкого спектра субстратов, богатый биосинтетический потенциал, позволяющий ацетобактериям развиваться в бедных синтетических средах и самостоятельно синтезировать многие факторы роста. Удивительная пластичность метаболических механизмов бактерий рода Acetobacter, способность быстро приспосабливаться к различным условиям среды обитания, привело к широкому распространению этих микроорганизмов в различных природных экосистемах, особенно в симбиозе с молочнокислой флорой [6, 7]. Вместе с тем, в составе микрофлоры человека ацетобактерии не встречаются, поскольку физико_химические условия биотопов не соответствуют биологической специфике данной группы облигатно-аэробных бактерий.
Уксуснокислые бактерии рода Acetobacter представляют наибольший интерес как экзогенные активаторы облигатно-анаэробной сахаролитической флоры, плохо приспособленной к жизнедеятельности in vitro и в связи с этим редко используемой в составе пробиотиков. Поскольку среди данной группы физиологически ценных бактерий существует много вариантов с высоким пробиотическим потенциалом, невозможность их рационального применения в составе препаратов препятствует повышению их эффективности и расширению ассортимента. На рис. 1 показана закономерность развития двух штаммов бифидобактерий: B. bifidum 83 и B. longum 410 — в чистой культуре и в сочетании со штаммом-активатором A. aceti K-92. Использование биологического активатора значительно интенсифицирует рост бифидной культуры и резко увеличиваетпродолжительность жизни популяции. В ходе исследования при выделении бифидобактерий культуру активатора наращивали в среде, в которую затем вносили субстрат, из которого планировалось выделение бифидофлоры. Затем продолжалось инкубирование до достижения максимальной плотности популяции. Образцы, в которых микроскопически выявлялись бифидобактерии, несколько раз перевивались в жидкую среду с активатором для увеличения их популяционного уровня. Полученные накопительные культуры высевали в агаризованную среду с последующим выделением типичных для бифидобактерий колоний. Изолированные колонии переносили в жидкую среду и после 3–5-суточного культивирования при температуре 37°С отбирали культуры, наиболее приспособленные к развитию в искусственных питательных средах. Таким образом было получено 269 штаммов бифидобактерий, способных сохранять жизнедеятельность in vitro.
Большинство выделенных штаммов бифидобактерий представляли собой грамм-положительные, аспорогенные палочки вариабельной формы. Наряду с тонкими прямыми зернистыми палочками, были выявлены клетки в виде запятой, неровных палочек с разветвлениями и утолщениями. Все культуры отличались облигатным анаэробиозом, не разжижали желатин, не восстанавливали нитраты в нитриты, не синтезировали каталазу. Выделенные штаммы были отнесены к 5-ти видам рода Bifidobacterium, а именно: B. bifidum, B. longum, B. infantis, B. breve, B. adolescentis.
Полученные в ходе исследования результаты не подтвердили укоренившееся с в микробной экологии мнение о преобладании в составе кишечной бифидофлоры, особенно у детей грудного возраста, представителей вида B. bifidum. По нашим данным, наиболее распространенным видом бифидобактерий у здоровых людей всех возрастных групп является B. longum. Вид B. Adolescentis ни разу не обнаруживался у детей грудного и раннего возраста и выделялся только у 20% взрослых людей. Высокое распространение B. longum, очевидно, связано с широкой ферментативной активностью данного вида бифидофлоры (табл. 1). Кроме того, полученные результаты установили более высокую жизнеспособность этих микроорганизмов и способность быстро адаптироваться к меняющимся условиям внешней среды.
Было установлено, что в норме в кишечном биотопе детей и взрослых одновременно содержится несколько от 3-х до 5-ти видов бифидобактерий. Поликомпонентность бифидной популяции биоценозов способствует расширению спектра ее полезных биологических активностей. Выявлены значительные вариации между различными штаммами бифидобактерий относительно их биологических свойств.
Большое значение имеет способность бифидобактерий, отличающихся высокой требовательностью к условиям культивирования и составу питательных сред, развиваться в молоке, являющимся основой многих препаратов и продуктов с пробиотическими функциями, с формированием высокого уровня клеточных популяций. Полученные штаммы свертывают стерильное молоко в течение 3–7_ми суток с накоплением в нем от 2,6.108 до 1,9.109 КОЕ/см3 популяций своих клеток (табл. 1).
При отборе штаммов бифидофлоры с перспективными пробиотическими свойствами особое значение придавалось способности синтезировать короткоцепочечные жирные кислоты. Все полученные штаммы при ферментации углеводов синтезируют, преимущественно, уксусную и молочную кислоту в соотношении 3:2, что соответствует классическому химизму сбраживания углеводов представителями рода Bifidobacterium. Кроме того, отдельные изоляты синтезируют небольшие количества муравьиной и янтарной кислоты (табл. 2).
Короткоцепочечные жирные кислоты выполняют важную роль в регуляции кишечных микробиоценозов иподдержании гомеостаза организма. При распаде этих метаболитов образуется много энергии, поэтому они служат дополнительным, автономным источником энергии для эпителия. Кроме того, уксусная кислота обеспечивает антимикробный эффект, участвует в липогенезе, регулирует рН в полости кишечника и моторику желудочно-кишечного тракта. Молочная кислота участвует, главным образом, в регуляции уровня рН и местного иммунитета и в глюконеогенезе, муравьиная кислота является активатором фагоцитоза и материалом для синтеза нуклеиновых кислот, а янтарная кислота участвует в энергетическом обмене, активирует ряд ферментов тканевого дыхания, улучшает синтез белка, обладает антиоксидантным эффектом. Гиполипидемическое действие микрофлоры и вазоактивные влияния обеспечиваются метаболическими эффектами короткоцепочечных жирных кислот. Поддержание пула этих метаболитов в толстой кишке путем восстановления нормальной микрофлоры необходимо для нормального функционирования макроорганизма, профилактики атеросклероза, рака ободочной и прямой кишки и ряда других серьезных заболеваний.
Особое значение в данной работе придавалось получению штаммов бифидобактерий, резистентных к естественным ингибиторам проксимального участка пищеварительного тракта.
Длительное время считалось, что бифидобактерии являются доминантной микрофлорой у детей раннего возраста, но не у взрослых. Поэтому бифидосодержащие бакпрепараты использовались, преимущественно, в неонатологии и педиатрии. Как известно, желудочный сок детей 1_го года жизни отличается низкой кислотностью (рН 4,0–4,5), которая не может значительным образом снизить количество клеток экзогенной микрофлоры, поступающей per os (в том числе, с пробиотиком). Невысокой является и бактерицидная активность тонкого кишечника. Поэтому при создании «детских» пробиотиков, вопросы резистентности микрофлоры к природным ингибиторам пищеварительной системы не являются ключевыми.
С возрастом антибактериальная система желудка и проксимального участка тонкой кишки быстро возрастает. У взрослых экстремально кислый желудочный сок (-рН 0,8–1,5), высокая концентрация желчи панкреатических ферментов и других ингибиторов роста микрофлоры в двенадцатиперстной кишке является одной из основных причин того, что полости этих участков почти стерильны (103–104 КОЕ/мл). Поэтому вопросам резистентности микрофлоры как факторам антимикробной защиты организма следует уделять должное внимание при создании пероральных пробиотиков для детей старше 2-х лет и взрослых.
Мониторинг исследуемых 269 штаммов бифидобактерий показал, что большая часть этих микроорганизмов достаточно чувствительна к воздействию многих бактерицидных компонентов секретов пищеварительного тракта, особенно желудочного сока, желчи и лизоцима. Выживаемость отдельных культур в средах, содержащих отдельные ингибиторы пищеварительной системы, не превышала 1–5%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что важнейшим фактором, определяющим эффективность пробиотика для перорального применения, является резистентность его микрофлоры к естественным ингибиторам желудочно-кишечного тракта. Это обусловливает необходимость селекции и отбора резистентных штаммов при создании пробиотиков. В ином случае микрофлора препарата не сможет достичь в активном состоянии основного микроэкологического локуса своей деятельности и проявить пробиотический эффект.
В ходе научной работы для селекции штаммов бифидобактерий с повышенной устойчивостью к желудочному соку, желчи, фенолу, хлористому натрию, лизоциму и протеолитическим ферментам использовали специально разработанные методы, основанные на усилении адаптивных механизмов микрофлоры при культивировании их в неблагоприятных условиях с последующим отбором клонов с ценными биологическими свойствами. В результате специально проведенных исследований было получено 88 штаммов бифидобактерий, характеризующихся высокой резистентностью.
На рис. 2 изображены сравнительные кривые, отражающие изменения концентрации популяции в среде с желудочным соком одного из селекционированных штаммов B. bifidum R/bb по сравнению с четырьмя штаммами бифидобактерий, не прошедших селекции. Как видно из рис. 2, популяции тест-культур через 3–10 ч выдержки в желудочном соке полностью инактивируются, в то время как популяция селекционированного штамма после 14-часового культивирования уменьшает свою плотность только на 40%. В табл. 3 приведена характеристика селекционированных штаммов бифидобактерий.
Культуры штаммов сохраняют не менее 50% популяции клеток после 2-часовой выдержки в желудочном соке; 60–70% — в среде, содержащей 0,4% фенола; 70–80% — в присутствии 20% желчи, а также обладают высокой резистентностью к лизоциму и протеолитическим ферментам. Степень выживаемости клеток в присутствии ингибиторов, к сожалению, редко учитывается при обосновании концентрации клеток в пробиотике. Многие современные препараты, предлагаемые для коррекции нарушений в микробной экосистеме, содержат в дозе 107.108 клеток пробиотической флоры. Если учесть, что биотопы пищеварительного тракта заселяет микробная популяция численностью 1014.1015 клеток, очень проблематичной является пробиотическая коррекция такого многочисленного и находящегося в состоянии высокой активности микробного сообщества за счет ослабленной лиофилизацией и защитными факторами макроорганизма «мизерной кучкой» пробиотических бактерий, многие из которых просто не доходят до толстого кишечника. Использование широко рекламируемых в последние годы пробиотиков, заключенных в кислоторезистентные капсулы, не может в достаточной степени решить данную проблему, поскольку такая капсула не обеспечивает защиту пробиотической флоры в двенадцатиперстной кишке, в которой условия для выживания микроорганизмов не менее экстремальные, чем в желудке.
Поэтому вопросы селекции штаммов для пробиотиков и создания прогрессивных биотехнологий, позволяющих получать препараты с высокой концентрацией активных клеток, остаются одними из наиболее приоритетных в области бактериальной терапии.
Выводы
Таким образом, практической реализацией многолетних теоретически_экспериментальных исследований в данной области явилась разработка нового поколения препаратов — мультипробиотиков группы Симбитер®. Центральное место в предложенной авторами концепции создания мультипробиотиков, широко представленной в ряде предыдущих работ, занимает методология искусственного биоконструирования многокомпонентного микробно-метаболитного комплекса, который можно рассматривать как модель естественного микроэкологического симбиоза физиологической бифидодоминантной нормобиоты человека.
При создании концентрированной формы мультипробиотиков учитывались степень инактивации части пробиотической популяции при транзите через желудок и тонкую кишку, а также высокую степень колонизации пищеварительного тракта человека разнообразными микробными сообществами, которые, как правило, оказывают мощное сопротивление процессу приживления в каждом конкретном биотопе экзогенной микрофлоры (в том числе, пробиотической).
По имеющимся данным, общее количество клеток микроорганизмов, в норме заселяющих биотопы гастроинтестинальной системы взрослых людей, превышает 1014. По нашим расчетам, для оказания препаратом биотерапевтического эффекта количество клеток физиологической микрофлоры, вводимой per os единоразово в организм взрослого человека, должно составлять не менее 1012. Данный показатель был взят за основу при создании концентрированных форм мультипробиотиков группы Симбитер®.
Благодаря концентрированию в препарате такой многочисленной полифункциональной популяции оздоровительной микрофлоры, способной, в частности, за счет высокой резистентности к естественным ингибиторам пищеварительного тракта, в активном состоянии достигать биотопа толстой кишки, и реализовывать свою многогранную активность, использование концентрированных мультипробиотиков приводит к эффективному устранению дисбиозов и повышению активности комплексной этиопатогенетической терапии больных различного профиля, что установлено многочисленными медицинскими исследованиями и длительным клиническим применением.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека и необходимость ее оптимизации / Сб. науч. тр. МНИИЭМ им. Габричевского «Бифидобактерии и их использование в клинике, медицине, промышленности и сельском хозяйстве». — М.,1986. — С. 10—17.
2. Бифидобактерии и использование их в молочной промышленности /Красникова Л.В., Салахова И.В., Шаробайко В.И. и др. — М.: АгроНИИТЭИмясомолпром (обзорная информация), 1992. — 30 с.
3. К вопросу о поликомпонентности пробиотиков / Лукьянова Е.М.,Янковский Д.С., Антипкин Ю.Г. и др. // Здоровье женщины. — 2005. — № 3(23). — С. 186—194.
4. Микроэкологические нарушения при клинической патологии и их коррекция бифидосодержащими пробиотиками / Воробьев А.А., Бондаренко В.М., Лыкова Е.А. и др. // Вестн. Рос. АМН. — 2004. — № 2. — С. 13—17.
5. Хамагаева И.С. Теоретическое обоснование и разработка технологии кисломолочных продуктов на основе использования â-галактозидазы и бифидобактерий: Автореф. дис. … д_ра тех. наук. — М., 1989. — 34 с.
6. Янковский Д.С. Микробная экология человека: современные возможности ее поддержания и восстановления. — К.: Эксперт ЛТД, 2005. — 362 с.
7. Янковський Д.С. Мікробіологічна характеристика системи «організм господаря — мікробіоценози різних екологічних ніш» як основа створення мультипробіотиків нових поколінь: Автореф. дис. ... д-ра. біол. наук. — Харків, 2006. — 52 с.
8. Янковский Д.С. Состав и функции микробиоценозов различных биотопов человека // Здоровье женщины. — 2003. — №4 (16). — С. 145—158.
9. Янковский Д.С., Дымент Г.С. Пробиотики ХХI столетия. Достижения, проблемы, дискуссии / Зб. пр. наук._практ. конф. «Роль пробіотиків в охороні здоров'я матері та дитини». — 2006. — С. 7—18.
10. Янковский Д.С., Дымент Г.С. Симбионты рода Bifidobacterium и стратегия их использования при конструировании мультикомпонентных пробиотиков // Современная педиатрия. — 2006. — № 1 (10).
11. Янковский Д.С., Дымент Г.С. Способ выращивания бифидобактерий: Авт. свид. 1604847, С 12 № 1/20, А 23 С 9/12 (СССР). — № 4628407/30—13. — Заяв. 29.12.1988 г., опубл. 07.11.1990. — Бюл. № 41.
12. Barclay L. Probiotic infant formula may help reduce gastrointestinal tract infection // Pediatrics. — 2005. — № 115. — P. 5—9.
13. Kagermeier_Callaway A.S. International commitee on Systematic Bacteriology. Subcommitee in the taxonomy of Bifidobacterium, Lactobacillus and related organisms. Minutes of the meetings, 4 and 6 Juli 1994, Praque, Czech. Republic // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. — 2000. — V. 50 (3). — P. 1391—1392.
14. The genome sequence of Bifidobacterium longum reflect its adaptation to the human gastrointestinal tract / Schell M.A., Karmirantzou M., Snel B. et al. // Proc. Natl. Sci. USA. — 2002. — V. 99, № 22. — P. 14422—14427.
Ключевые слова: микрофлора, пробиотики, дисбиоз.
Ключові слова: мікрофлора, дисбіоз, пробіотики, Симбітер.
Key words: microflora, probiotiks, disbiose.
Реклама:
книги купить медицина, английский
кредит ваз 2115 | kia cerato цена | мазда 6 обнавлённая |
|
|
|
